CYTOMYX - Auszug aus "ModernDrugDiscovery" - 500 Beiträge pro Seite

[moz01]

"THE MATCHING THE GAME"

Protein-based biochips are making strides in proteomics and diagnostics.



Diagnostics

One of the prime areas in which researchers are looking to apply protein chips is the development of diagnostic tools. Unlike the use of MS for diagnosis and biomarker discovery (see “Diagnosing newborns”), the application of protein chips does not necessarily require the financial investment inherent in the purchase of a mass spectrometer, making it an attractive alternative. Furthermore, improvements in detection limit (approaching femtomolar levels) and their ability to pull biomarkers directly from complex mixtures without resorting to preliminary purification have established protein chips as a hot area of research.

In February, Emanuel Petricoin, a researcher at the U.S. FDA (Bethesda, MD), and his colleagues presented their experiences in using serum protein patterns to identify individuals with ovarian cancer (1). Petricoin’s group incubated Ciphergen’s C16 hydrophobic interaction protein chips with serum from women with and without ovarian cancer and elucidated patterns of proteins that were specific to the cancer. These patterns then served as a template against which blind serum samples were tested. The pattern matching correctly classified 63 of 66 noncancerous or benign samples and all 50 cancerous samples.

“After proper validation, serum proteomic pattern analysis might ultimately be applied in medical screening clinics as a supplement to diagnostic workup and assessment,” Petricoin wrote. “A negative value, if the sensitivity remains at 100% on further trials, could be used for reassurance, whereas a positive value might be sufficient to warrant further investigation.”

While Petricoin’s group only looked at protein patterns, other groups have been vocal about the need to identify the actual proteins associated with the disease. For some of these people, protein chips present an ideal method.

“Take prostate cancer, where there is only the prostate-specific antigen (PSA), which is secreted in sera,” says Moncef Jendoubi, founder of Milagen, Inc. (Richmond, CA, www.milagen.com). “The PSA is secreted as a result of the enlargement of the prostate as we age and is not indicative of cancer. We applied almost 15,000 antibodies, each recognizing a separate protein, and identified, in individuals suffering from prostate cancer, 164 proteins that are not PSA.”

While Milagen is making strides with its antibody program, other companies are entering the diagnostic protein chip market. In early 2001, Large Scale Biology Corp. (LSBC, Germantown, MD, www.lsbc.com) announced a collaborative agreement with Biosite Diagnostics (San Diego, CA, www.biosite.com). By combining LSBC’s Human Protein Index with Biosite’s high-throughput Omniclonal phage display technology, the companies hope to generate antibody arrays against various human diseases.

Similarly, this past January, NextGen Sciences (Alconbury, U.K., www.nextgensciences.com) initiated a collaborative project with Cytomyx (Cambridge, U.K., www.cytomyx.com) and Carlos Caldas of the University of Cambridge (U.K.) to generate a range of protein chips targeted at breast cancer.

“My research group has been studying breast cancer at the gene and mRNA levels using human biopsy cell lines as well as primary tumors with linked, appropriately anonymized clinical information,” says Caldas. “This initiative allows us to access new technology in protein expression analysis and to combine this with the genomics and transcriptomics information we are already gathering.”

[BarnyXXL]

Das Posting von Jetti lässt sicher nicht lange auf sich warten ....

Gruß Barny

[carlomania]

Mai 2002
Vol. 5, Nr. 5, pp. 26-28, 30, 32-33.
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Das zusammenpassende Spiel
RANDALL C. WILLIS

Proteinbasierte Biochips bilden Fortschr1tte im proteomics und in der Diagnose.

Für einige Jahre während Wissen der menschlichen genetischen Ergänzung erweiterte, wurden Versprechungen hinsichtlich unseres Verständnisses gebildet, von wie Zellen normalerweise arbeiten und von wie Krankheit weiterkommt, wenn sie nicht.

In hohem Grade basierte diese Versprechung auf genomic Analyse mit DNA- oder Genspänen, Werkzeuge, die die geringfügigsten Änderungen in den Genreihenfolgen- oder RNS-Ausdrucksmustern unterscheiden. Aber, während Forscher mehr über die Biochemie des Metabolismus und der Krankheit erlernten, fingen sie an, festzustellen, daß diese Versprechung groß unrealized gehen würde, wenn sie auf Genspäne alleine bauten.

Jede Zelle in einer Bevölkerung der Einzelpersonen enthält groß die gleichen Gene und obgleich der Ausdruck dieser Gene mit Zeit oder Bedingungen ändern kann, den Hauptteilnehmer im zellularen Metabolismus ist nicht Nukleinsäure aber Protein. Sie ist nur sinnvoll, folglich, zu den Proteinen zu schauen, um Anzeigen über menschliche Gesundheit und Krankheit zu übermitteln. Zu diesem Zweck ist eine neue Industrie auf die Fersen von DNAMICROARRAYS gefolgt, und wir erreichen die Ära der Proteinspan- und -antikörperreihen.

Spanchemie
Der erste Schritt, wenn er einen Proteinspan entwickelt, ist das Zubehör der Proteine oder der Antikörper zu einer festen Unterstützung, und dieses kann vollendet werden, indem man eine Vielzahl von Oberflächenchemie verwendet (sehen Sie auch "eine verbindliche Angelegenheit" ). Einige Späne verwenden Ionenaufladung oder hydrophobicity, um die Proteine des Interesses zu binden. So ist der Fall mit einigen der Proteinspäne, die von internationalem (vorhanden sind Uppsala, Schweden, www.biacore.com ) und Biosysteme Biacore Ciphergen (Fremont, Ca, www.ciphergen.com ).

Leider obgleich diese Späne für globale Proteinstudien nützlich sind, sind sie nicht sehr spezifisch. Aus diesem Grund haben Firmen wie Prolinx (Bothell, WA , www.prolinxinc.com) Affinitätssysteme so entwickelt, daß eine bestimmte Hälfte auf dem Span direkt an einen Partner bindet, der zum Protein des Interesses angebracht wird. Im Span Prolinx ist das chemische Paar phenylboronic Säure und salicylhydroxamic Säure; andere Paare schließen Biotin und streptavidin und Nickel und hexahistidine mit ein.

Für sogar spezifischere Schwergängigkeit jedoch kann nichts mit dem Gebrauch der Antikörper oder der Antikörpernachahmer konkurrieren. Innerhalb des Bereiches der Antikörper, bieten monoclonals die festeste Schwergängigkeit an; polyclonals bieten Verschiedenartigkeit des Bindens an, die kritisch werden kann, wenn Sie noch Ihr verklemmtes Protein arbeiten wünschen; und Einketten- oder Bakteriophagenanzeigenmoleküle bieten grössere Stabilität an. Folgend in die Einkettenader, sind Antikörpernachahmer kleine Proteine, die ausgeführt worden sind, um auf ihr Partnerprotein einzuwirken. Diese umfassen die trinectins von Phylos (Lexington, MA, www.phylos.com ) und von affibodies von Affibody (Stockholm, www.affibody.com ).

Abfragung




Tabelle 1. Der SELDI-Prozeß

Unabhängig davon welche Zubehörmethode verwendet wird, Abhängigkeiten zwischen Proteinen und ligands oder anderen Proteinen ist zu ermitteln der Name des Spiels. Zu diesem Zweck sind verschiedene Technologien hergestellt worden, um Punkte der Abhängigkeit zu kennzeichnen, von denen einige Ableitung der DNA-Spantechnologien sind. Firmen wie Ciphergen und LumiCyte (Fremont, Ca, www.lumicyte.com ) bauen auf Oberfläche-erhöhte Laserdesorption-Ionisierung-Massenspektrometrie (Seldi-Ms), hingegen Laserlicht die Proteine desorbiert und ionisiert, die zu einem Span gesprungen werden (Tabelle 1). Die ionisierten Moleküle kommen dann ein Massenspektrometer, in dem ihr Aufbau und Masse ermittelt werden ( www.seldi.org ). Mit Seldi-Ms müssen die verklemmten Proteine nicht beschriftet werden.

Eine andere Technik, die nicht das Proteinbeschriften erfordert, ist Oberflächenplasmonresonanz (SPR), wie durch das System illustriert, das von Biacore entwickelt wird. In chip-based SPR werden Zielproteine zur Spanoberfläche gesprungen, und ein Grundlinienbrechungsindex wird hergestellt. Eine Mischung der möglichen ligands oder der Proteine wird dann über den Span geführt, und Abhängigkeiten zwischen den Lösung-Phasenmolekülen und Span-springen Proteine werden gemessen als Änderung im Brechungsindex.

Wechselweise beruhen viele Labors auf dem Gebrauch der Leuchtstoff oder Radioisotopumbauten. Der Umbau kann direkt zu den Proteinen in der Lösung angebracht werden, die geprüft wird oder kann ein Bestandteil Sekundärantikörpers wie die sein, die in der westlichen Analyse verwendet werden.

In hohem Grade obwohl, wie die Proteine ermittelt werden, hängt von ab, was Instrumenten für einen Forscher und, sogar so vorhanden sind, was Anwendung der Forscher im Verstand hat.

Diagnose
Einer der Hauptbereiche, in denen Forscher schauen, um Proteinspäne anzuwenden, ist die Entwicklung der Diagnosewerkzeuge. Anders als den Gebrauch des MS für Diagnose und biomarkerentdeckung (sehen Sie "die Diagnose der Neugeborener" ), erfordert die Anwendung der Proteinspäne nicht notwendigerweise die finanzielle Investition, die im Erwerb eines Massenspektrometers zugehörig ist und bildet es eine attraktive Alternative. Ausserdem haben Verbesserungen in der Nachweisgrenze (nähernde femtomolar Niveaus) und in ihrer Fähigkeit, biomarkers direkt von den komplizierten Mischungen, ohne Zuflucht zu nehmen zur einleitenden Reinigung, zu ziehen hergestellt Proteinspäne als heißer Bereich der Forschung.

Im Februar stellten Emanuel Petricoin, ein Forscher an der STAAT-FDA (Bethesda, MD) und an seinen Kollegen ihre Erfahrungen dar, wenn sie Serumproteinmuster verwendeten, um Einzelpersonen mit ovarian Krebs (1) zu kennzeichnen. Gruppe Petricoins brütete Abhängigkeits-Proteinspäne C16 Ciphergens hydrophobe mit Serum von den Frauen mit und ohne ovarian Krebs aus und klärte Muster der Proteine auf, die zum Krebs spezifisch waren. Diese Muster dienten dann, während eine Schablone, gegen die blindes Serum probiert, geprüft wurden. Musterrichtig zusammenpassen stufte 63 von 66 noncancerous oder von gutartigen Proben und von allen 50 cancerous Proben ein.

"nach korrekter Gültigkeitserklärung, proteomic Musteranalyse des Serums konnte in den medizinischen Siebungkliniken als Ergänzung am Diagnoseworkup schließlich zugetroffen werden und Einschätzung," Petricoin schrieb. "ein negativer Wert, wenn die Empfindlichkeit bei 100% auf weiteren Versuchen bleibt, könnte für Versicherung verwendet werden, während ein positiver Wert genügend sein konnte, weitere Untersuchung zu gewährleisten.",

Während nur Gruppen Petricoins Proteinmuster betrachteten, sind andere Gruppen über die Notwendigkeit, die tatsächlichen Proteine zu kennzeichnen vocal gewesen, die mit der Krankheit dazugehörig sind. Für einige dieser Leute, stellen Proteinspäne eine ideale Methode dar.

"nehmen Sie Prostatakrebs, in dem es nur das Prostata-spezifische Antigen (PSA) gibt, das in den Seren abgesondert wird," sagt Moncef Jendoubi, Gründer von Milagen, Inc. (Richmond, Ca, www.milagen.com ). "das PSA wird resultierend aus der Vergrößerung der Prostata abgesondert, während wir altern und ist nicht vom Krebs hinweisend. Wir wendeten fast 15.000 Antikörper, jeden an, der ein unterschiedliches Protein erkennt und kennzeichneten, in den Einzelpersonen, die unter Prostatakrebs, 164 Proteine leiden, die sind- nicht PSA.",

Während Milagen Fortschr1tte mit seinem Antikörperprogramm bildet, tragen andere Firmen den Diagnoseproteinspanmarkt ein. Frühem 2001, verkündete große Skala Biology Corp. (LSBC, Germantown, MD , www.lsbc.com) eine gemeinschaftliche Vereinbarung mit Diagnose Biosite (in San Diego, in Ca, in www.biosite.com ). Indem sie LSBCs menschlichen Proteinindex mit HochdurchsatzOmniclonal Biosites Bakteriophagenanzeigentechnologie kombinieren, hoffen die Firmen, Antikörperreihen gegen verschiedene menschliche Krankheiten zu erzeugen.

Ähnlich leitet dieser letzte Januar, Wissenschaften NextGen (Alconbury, Großbritannien , www.nextgensciences.com) ein gemeinschaftliches Projekt mit Cytomyx (Cambridge, Großbritannien, www.cytomyx.com ) und Carlos Caldas der Universität von Cambridge ein (Vereinigtes Königreich.) eine Strecke der Proteinspäne erzeugen gezielt am Brustkrebs.

"meine Forschungsgruppe hat Brustkrebs am Gen studiert und mRNAniveaus mit menschlichen Biopsiezellenlinien sowie Primärtumoren mit verbunden, anonymized passend klinische Informationen," sagt Caldas. "diese Initiative erlaubt uns, neue Technologie in der Proteinausdrucksanalyse zugänglich zu machen und dieses mit den genomics- und transcriptomicsinformationen zu kombinieren, die wir erfassen bereits.",

Prognose und pharmacoproteomics
Aber Diagnose ist ein rückwirkender Fall, und viele Forscher glauben, daß die Bevölkerung besser mit einem Werkzeug gedient würde, das Krankheitprognose erlaubt.

"Sie können sich vorstellen, einen Antikörperspan für vorbestimmte Medizin zu haben," sagt Jendoubi. "sobald Sie eine Anzahl von den Proteinen gekennzeichnet haben, die in den Seren oder im Urin abgesondert werden, Sie trennen können durch das die Proteine werden verbunden mit früher Krankheit, der Angriff von Metastasis, den tut und nicht Behandlung, giftige Effekte zuläßt und der ist vornübergeneigt zum Widerstand oder zum Rückfall.",

Grundlegend stellen Sie ein pharmacoproteomic Profil einer Einzelperson her. Wie pharmacogenomics das Forscher und Klinikern erlaubt, die Antwort einer Einzelperson zur Drogebehandlung auf der Grundlage von sein oder genetisches Profil vorauszusagen, erlaubt das entwickelnde Feld von pharmacoproteomics Drogeentwickler und -klinikern, die behandelte Bevölkerung weiter zu unterteilen.

"wie andere, glauben wir, daß die Verwendbarkeit von Proteinbiochips entwarf, Giftigkeit auszuwerten und Wirksamkeit den Forschungsprozeß drastisch ändern kann," sagen Gunars Valkirs, Vizepräsident und technischen hauptsächlichoffizier von der Diagnose Biosite.

Proteomics
Obgleich viel Aufmerksamkeit auf die klinische Anwendung der Proteinspäne gerichtet wird, lagern zukünftige Entwicklungen groß auf ihrem Gebrauch im proteomics schwenkbar. Da mehr Proteine gekennzeichnet werden und für Gebrauch in den verschiedenen Anwendungen vorhanden werden, bringt Druck an, um ihre Rollen in der Zelle festzustellen und wie sie auf anderen Partnern beziehen, ob kleine Moleküle, Nukleinsäuren oder andere Proteine.

Im Aufbau der Proteinabhängigkeitsdiagramme, bieten Proteinspäne Vorteile über den traditionelleren Methoden an. In der HefeZweimischlingsiebung wird ein Protein zum DNA-bindenen Gebiet eines Übertragungfaktors (der Köder) fixiert, und die Proteine in der zu analysierenden Mischung werden zum transcriptionalaktivierungsgebiet eines anderen Proteins fixiert (das Opfer). Wenn die wechselwirkenden in vivo des Köders und des Opfers, sie die Übertragung eines Reportergens aktivieren.

Einer der Hauptvorteile eines Proteinspanes ist, daß, während der Forscher wenig Steuerung über den Bedingungen hat, unter denen die Schmelzverfahrensproteine in der Hefezelle aufeinander einwirken, es reichliche Gelegenheit gibt, die Reaktionsbedingungen auf einem Span zu ändern. Dieses beseitigt effektiv viele der falschen positiven Abhängigkeiten, die im HefeZweimischlingsystem zugehörig sind. Ausserdem obgleich der Ausdruck eines natürlichen Übertragungfaktors eine Reaktion im Hefesystem auslösen kann, ist dieses gleiche Protein ein anderer Punkt auf dem Proteinspan gerade und wieder begrenzt die Gefahr der falschen Positive.



Figure 2. Bound to deliver. Researchers tested chips carrying histidine- and GST-tagged yeast proteins (top) to identify polypeptides that bind calmodulin and phospholipids (bottom). (Adapted with permission from Reference 3.)

Recently, Michael Snyder and his colleagues at Yale University and North Carolina State University (Raleigh) developed a yeast protein chip by tagging the 5800 genes of the microbe with sequences encoding six histidine residues and attached the resulting proteins to a Ni+-coated slide (2). The researchers then probed the array with calmodulin, a Ca2+-binding protein involved in calcium-regulated cellular processes. Beyond identifying six of the known calmodulin-binding proteins in yeast, the array identified another 33 potential partners (Figure 2).

Protein arrays also facilitate the identification or characterization of the enzymatic activity of proteins. This is potentially useful to the pharmaceutical industry, in which companies are searching for small molecules that bind to specific proteins in the proteome or interrupt the protein’s activity. In 2000, Gavin MacBeath and Stuart Schreiber of Harvard University (Cambridge, MA) described their experiences in developing an array of peptides and determining which one was a substrate for a particular kinase (3). They incubated the slides in the presence of a kinase and radiolabeled ATP. As anticipated, each of the substrates was radiolabeled by its respective kinase. Similarly, Snyder’s group probed the yeast array described in the preceding paragraph with various phospholipids and identified 150 lipid-binding proteins (Figure 2).

Drug development
Although the flow of protein chips to market has been slow, the market is beginning to pick up. In January, Sense Proteomic (Cambridge, U.K., www.senseproteomic.com) announced the release of its ExpressArray p53, a collection of normal and mutant human p53 proteins, the first commercial result of its collaboration with the robotics company Genetix Group plc (Congleton, U.K., www.genetix.com). The protein is a transcription factor that acts as a natural tumor suppressor in human cells. In more than half of all human cancers, p53 function is lost and the regulation of cell death (apoptosis) is disrupted. If function could be returned to the protein, then perhaps the cancers could be reversed. Thus, it is important to find compounds that will bind to the protein. To that end, protein chips such as this serve as a scaffold on which to test small-molecule ligands for potential therapeutic activity.

Prospects
So what is next for protein chips and antibody arrays? Although there are still many technological barriers to overcome—including protein production and stability, as well as sensitivity—the market is expanding, as is the number of commercial chips and chip systems. According to Stanford University professor Pat Brown, the success of the protein chip is virtually a sure thing (4). “But what will be the best technology, and how soon,” he adds, “remains to be seen.”

References

Petricoin III, E. F.; et al. Lancet 2002, 359, 572–577.
Zhu, H.; et al. Science 2001, 293, 2101–2105.
MacBeath, G.; Schreiber, S. L. Science 2000, 289, 1760–1763.
Service, R. F. Science 2001, 294, 2080–2082.


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Randall C. Willis is a senior associate editor of Modern Drug Discovery. Send your comments or questions regarding this article to [e-mail] or the Editorial Office by fax at 202-776-8166 or by post at 1155 16th Street, NW; Washington, DC 20036.

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